Aflatoxin termelő képesség vizsgálata a laborban

Kedves olvasók! Sajnos a múlt hónapban elcsúsztam az augusztusi beszámolóval, ezért ebben a hónapban két bejegyzésem is született. Folytatva az eddigi vonalat most is aflatoxinokról fogok írni, viszont ebben a bejegyzésben bemutatom, hogy a vizsgálataimat hogyan is végzem el a laborban. Ezen kívül néhány érdekességet is bemutatnék, mellyel Indiában találkoztam.

Több különböző módszer kipróbálását követően a következőképpen történik az Aspergillus flavus izolátumok aflatoxin termelő képességének vizsgálata a csoportunkban. Először is egy indukáló tápoldatot készítünk, mely 2% élesztő kivonatot és 20% szacharózt tartalmaz. A szacharóz vagy étkezési cukor (nádcukor, répacukor, juharcukor) egy diszacharid, melyet egy glükóz és egy fruktóz molekularész alkot (C₁₂H₂₂O₁₁). A növények termelik és a heterotróf élőlények fontos tápláléka. Nagyon fontos még, hogy ne legyen csökkentett az élesztőkivonat sókoncentrációja.

Ezt követően a tápoldatot félkémcsövekbe mérjük, sterilizáljuk, majd a vizsgálni kívánt izolátumokat beleoltjuk. Az aflatoxin termelésnek kedvező feltétel a meleg, ezért 25 és 30 °C-on is vizsgáljuk az izolátumok aflatoxin termelő képességét. Az inkubáció 7-10 nap sötétben, ugyanis az aflatoxin fény hatására bomlik.

Ezután elvégezzük a toxin extrakciót. Mi általában diklór-metánt, vagy kloroformot használunk. Az extrakció során a toxin a vizes fázisból a szerves fázisba kerül. Centrifugálással a két fázis jól elkülöníthető. A szerves fázissal dolgozunk tovább. Mikrocentrifuga csövekbe mérjük a mintákat (általában 1-2 ml) és a szerves oldószer elpárologtatásával betöményítjük a mintákat.

Végül kis mennyiségű szerves oldószerben (kloroform ebben az esetben) újra felvesszük a mintát és vékonyréteg kromatográfiával vizsgáljuk. A vizsgálathoz rendelkezésünkre áll egy készülék (Camag, Linomat5), mely nagyban megkönnyíti a minták rétegre történő felvitelét. 

A felvitelt a réteg futtatása követi. Több próbálkozás után a toluol:etil-acetát:hangyasav 6:3:1 arányú keverékét találtuk a leghatékonyabb futtatóelegynek. Ebben az esetben a különböző extrahált metabolitok jól elkülönültek egymástól és az alkalmazott aflatoxin standard segítségével könnyen azonosíthatóak a mintákban a különböző aflatoxin formák. Az UV-fény alatt mutatott kék illetve zöld fluoreszcenciájuk alapján, valamint az eltérő Rf (retenciós faktor) értékek alapján, megkülönböztetünk aflatoxin B₁, B₂, G₁ és G₂-t („B-blue”, „G-green”).

Fent látható néhány kép a futtatás menetéről, egy futtatókádról és egy rétegről, melyet a Camag honlapjáról töltöttem le, mivel én nem rendelkezem ilyen szép fotóval.

Végezetül néhány érdekesség:

Lehetőségem volt tavaly novemberben egy hónapot eltölteni Indiában, ahol bepillantást nyerhettem egy szemklinika mikrobiológiai laboratóriumának, valamint egy egyetemi mikrobiológiai laboratórium munkájába is. A kinti hallgatók is vizsgálták az Aspergillus flavus izolátumok aflatoxin termelő képességét egy egészen más módszerrel. Kókusztejből készítenek táptalajt, amelyre egy specifikus (AFPA) táptalajon előnevelt A. flavus izolátumokat oltanak. Ha az adott izolátum termel aflatoxint, akkor UV fény alatt látható egy fluorszcens anyag a táptalajban. Ezt a kísérletet itthon is elvégeztem, de nem bizonyult olyan hatékonynak, mint a vékonyréteg kromatográfia. Indiában azért használhatják, mivel nagyon könnyen hozzájutnak a friss kókuszhoz, ezáltal nagyon olcsó, valamint nem kell egyéb szerves oldószerekkel, illetve analitikai módszerekkel dolgozniuk. Íme néhány csészefotó a konzerv kókusztejből készült táptalajon végzett kísérletről.

Mikotoxinokról általában

Az előző bejegyzésekben már sokat írtam az aflatoxinokról, melyek az Aspergillus nemzetségbe tartozó fonalas gombák közül néhány képes előállítani. Viszont az aflatoxinokon kívül számos más jelentős mikotoxin létezik. Ebben a bejegyzésben a mikotoxin-termelésről, a mikotoxikológia létrejöttéről lesz szó.

A gombák különböző módon károsíthatják az embert illetve az állatokat: 

Okozhatnak különböző mikózisokat, mikotoxikózisokat, micetizmusokat.

lDefiníció: fonalasgombák általában másodlagos anyagcsere-termékei, melyek az embert és/vagy az állatokat valamilyen módon károsítják .

lJelentőség: az ember és háziállatai táplálékát, illetve környezetét szennyezhetik, különböző kórképeket válthatnak ki.

Itt tisztáznám a másodlagos metabolitok fogalmát is:

Nem elengedhetetlenül szükségesek a sejt életben maradásához, ellentétben az elsődleges anyagcseretermékekkel . Nem fordulnak elő minden élőlényben, csak néhány faj termel egy adott vegyületet. Általában kis méretűek és a sejt életének csak egy adott szakaszában termelődnek. Szerepük többnyire ismeretlen.

Ezzel szemben az elsődleges metabolitok: 

lA normális növekedéshez, reprodukcióhoz, fejlődéshez szükségesek, általában a log fázisban termelődnek . Szigorúan szabályozott termelődésük.Tudjuk, mi mire való.

A mikotoxinok több, különböző módon is bejuthatnak a szervezetbe.

lKözvetlen szennyezésként (szennyezett növény fogyasztása révén, pl. liszt)

lKözvetve (mikotoxinnal szennyezett takarmányt fogyasztó állatokból származó élelmiszerek révén; pl. sertés vese)

lÉlelmiszeriparban alkalmazott mikotoxin termelő gombák okozta szennyezés révén (pl. fermentált szalámi, szójaszósz)

lGombaspórák belégzése (ochratoxinok, makrociklikus trichotecének)

lGombafertőzés hatására a szervezetben is termelődhet (ochratoxinok, fumonizinek, gliotoxin, oxálsav)

Néhány mikotoxin hatásmódja látható ezen az ábrán.

Mikotoxikológia

A mikotoxinokkal foglalkozó tudományág az 1960-as években jött létre. Ekkor ugyanis egy rejtélyes betegség pusztított a pulykák körében Angliában, mely több mint 100.000 pulyka elhullását okozta. A vizsgálatok során májkárosodást mutattak ki az állatokban. A betegséggel a takarmányba kevert toxinnal szennyezett földimogyorót hozták összefüggésbe. A tápból egy fonalasgombát is izoláltak, melyet Aspergillus flavus-ként azonosítottak. A toxikus anyagot, utalva a termelő gombára, aflatoxinnak nevezték el. 

Végezetül egy képet választottam, amelyre összegyűjtöttem néhány olyan élelmiszert, melyek tartalmazhatnak mikotoxinokat. Tehát nem törvényszerű, de előfordulhat mikotoxin szennyezés számos fermentált-, húsipari-, tejipari élelmiszerben, importált termékekben, valamint hazai mezőgazdasági termékekben is.

Toxinmentesítési technikák

Amint azt az előző bejegyzésem végén megemlítettem, ma a toxinmentesítési technikákat szeretném bemutatni.

A mikotoxinok detoxifikálására, eliminálására fizikai, kémiai és biológiai módszerek is léteznek. 

a. Fizikai módszerek

• A legegyszerűbb módszer a hígítás, azaz a toxintartalmú takarmány toxinszegény, vagy toxinmentes takarmánnyal való összekeverése. Az EU szabályozása azonban ezt a megoldást tiltja.  DE: más országokban nem tilos (pl. Mexikó, Afrika, India, stb.
• Hőkezeléskor 150-200°C-os hőmérsékletnek teszik ki a kezelendő anyagot, ez egyes esetekben fumonizin B1 szennyezettség esetén alkalmazható. Viszont a legtöbb mikotoxin igen hőstabil, ezért ez az eljárás nem túl célravezető.
• Az átmosásos eljárás (vízzel vagy Na-karbonát oldattal) DON (deoxynivalenol), zearalenon,valamint fumonizin szennyezettség mértéke csökkenthető. 
• Bizonyos esetekben alkalmazható mikrohullámú kezelés (trichotecének) és gamma-sugárzás (ochratoxin) is.

b. Kémiai kezelés

• Erős alkalikus kezelés (probléma azonban a neutralizáció): aflatoxinnál bevált, a csökkenés mértéke akár 90 % is lehet, de más toxinoknál a hatás kérdéses (pl. T-2 stabil). Fumonizin esetében az alkalikus kezelést redukáló cukorral kombinálva N-(karboximetil)-fumonizin jön létre, amely lényegesen kevésbé toxikus vegyület és a fumonizin mennyisége akár 20 % alá csökkenthető. 
• Alkalikus nátrium-hipoklorit kezelés a T-2 toxin esetében hatásos, de neutralizációs problémák és a kezelésre alkalmazott készítmény korrozív jellege miatt nem elterjedt. 
• Nátrium-bikarbonát 0,2-0,3 % mennyiségben adagolva a takarmányhoz ochtratoxin esetében csökkenti a toxicitást. 
• Oxidatív kezelések: pl. hidrogén-peroxid: a zsírokat károsítja, hatása kérdéses. A neutralizációja nem megoldott. 
• Felületaktív anyagok: alkalmazásuk során tekintetbe kell venni, hogy a mikotoxinok mellett más, hasonló karakterű vegyületeket is megkötnek - pl. vitaminok, peptidek, aminosavak, továbbá a mikotoxinok kémiai karaktere igen eltérő, és a takarmányokban általában nem egyféle mikotoxin van jelen, így megkötésükre sokszor nem elegendő egyetlen ún. toxinkötő vegyület!) 
• pl. kaolin → drága és csak az aflatoxin esetében bizonyult hatásosnak, 
• pl. rostkiegészítés → a hatása kérdéses és egyéb kedvezőtlen hatás is lehet (a trichotecén vázas toxinok a búzakorpában akkumulálódnak), 
• pl. bentonit → az alapanyag sokszor nehézfémekkel szennyezett, 
• pl. aktív szén (carbo medicinalis) → nem gyakorlatias - igen nagy mennyiség (5-10 %) szükséges, 
• pl. montmorrilonit (acidikus) → megköti a zearalenont, 
• pl. aluminium szilikátok → köti a poláros mikotoxinokat – pl. aflatoxinokat (sajnos egyéb anyagokat fémek, vitaminok is ), 
• pl. szerves aluminium szilikát komplexek → kötik az apoláros mikotoxinokat, zearalenont, ochratoxint. 
• Specifikus kötőanyagok: a legfontosabb feltétel a toxinkötő anyagokkal szemben, hogy a bélcsatornában lévő enzimeknek – mind az állat saját enzimjei, mind a bélcsatornában lévő mikro-organizmusok által termelt enzimek - ellenálló legyen.  Egyes szénhidrátok, így pl. a mannán oligoszacharidok (élesztő sejtfal kivonatok) toxinkötése a bélcsatornában feltehető, de hatásuk zömében csak in vitro bizonyított és drágák. Pozitív hatásuk, hogy a szervezet és a baktériumok által termelt enzimeknek rendkívüli mértékben ellenállóak. Alkalmasak mind a poláris, mind az apoláris mikotoxinok megkötésére (de nem azonos mértékben).  Cholestyramine, hatásos anion cserélő gyanta, korábban az epesavak megkötésére használták, a zearalenont és a T-2 toxint is hatékonyan köti, de drága. (forrás: Búza László és mtsi. 2008, Lovak takarmányozási eredetű idegrendszeri megbetegedései. Mezőgazdasági Szakigazgatási Hivatal Központ Élelmiszer- és Takarmánybiztonsági Igazgatóság kiadványa)
• Aflatoxinnal szennyezett takarmány detoxifikálását ammonizálással alkalmazzák az USA-ban, Franciaországban, Nagy-Britanniában és Afrikában. VISZONT: Az Európai Közösségben az emberi fogyasztásra szánt árucikkek kémiai kezelése nem megengedett. 

c. Biológiai módszerek

• Ennek során a mikotoxinok lebomlanak vagy átalakulnak egy nem- vagy kevésbé toxikus metabolittá 
• Az aktív ágensek lehetnek (aflatoxin degradáció esetén):  
• baktériumok (Flavobacterium aurantiacum, Nocardia asteroides, Corynebacterium rubrum, Mycobacterium fluoranthenivorans, Rhodococcus erythropolis) 
• gombák (Aspergillus parasiticus )
• enzimek (lakkáz, aflatoxin-detoxifizyme) 

A mezőgazdasági termékek mikotoxinokkal való szennyeződése igen komoly problémát jelent. Ezzel kapcsolatban számos fórumon találunk bejegyzéseket.

Illetve találtam néhány terméket, amelyet sikeresen alkalmaztak takarmányok aflatoxin-mentesítésére. 

http://www.biomin.net/hu/termekek/mycotoxin-kockazatkezeles/mycofixr/

http://www.anitech.hu/takarmanyozas/120-szarvasmarha-takarmanyok-toxin-szennyezettsegenek-csokkentese

A mai bejegyzésemet egy nagyon vicces képpel zárnám. 1 hónap múlva újra jelentkezem.

Aflatoxinok előfordulása hazánkban

AFLATOXINOK 2.

Korábbi bejegyzésemben röviden ismertettem az aflatoxinok előfordulását, a termelő fajokat, a káros hatásukat, valamint előfordulásukat különböző mezőgazdasági termékekben. 

Mostani bejegyzésemben a hazai mezőgazdasági termékek aflatoxin szennyezettségéről írok majd.

Az aflatoxin termelés  kedvező környezeti feltétele a nedvesség és a magas hőmérséklet. Ezért az A. flavus melegebb, trópusi és szubtrópusi területeken képes aflatoxinokat előállítani. Következtetésképpen, a közép-európai országokban (Olaszország, Szerbia, Szlovénia, Horvátország, Románia, Ukrajna), melyek a mérsékelt éghajlati övben helyezkednek el, a mezőgazdasági termékek aflatoxin -szennyezettsége eddig nem jelent ett komoly egészségügyi kockázatot.

Azonban a globális felmelegedés által okozott klímaváltozás jelentős változásokat idézett elő. Az utóbbi időben több tanulmány is foglalkozott az éghajlatváltozás hatására megjelenő aflatoxin termelő gombákkal és az aflatoxinok élelmiszerekben történő előfordulásával. 

Létezik egy az EU tagországokban működő, az élelmiszerekre és a takarmányokra vonatkozó gyorsvészjelző rendszer (RASFF, Rapid Alert System for Food and Feed). A tagállamok haladéktalanul jelentik a Bizottságnak a sürgősségi riasztórendszeren keresztül az élelmiszerekből és takarmányokból származó, az emberi egészséget közvetve vagy közvetlenül érintő veszélyt. A rendszer kiterjed a tagállamokra, a Bizottságra és a Hatóságra. A RASFF rendszerében a beérkező bejelentések, az élelmiszer-biztonsági kockázat mértéke alapján több kategóriába sorolhatók.

Ezen jelzőrendszeren keresztül az utóbbi közel 10 évben számos riasztás érkezett közép-európai országokból. Így Horvátországban aflatoxin termelőket azonosítottak kukoricán (Kosalec & Pepeljnjak 2005, Halt és mtsi. 2004). Észak-Olaszországban aflatoxin termelő A. flavus-t és EU határérték feletti aflatoxin kontaminációt detektáltak kukoricán (Giorni és mtsi. 2007). Szlovéniában és Szerbiában EU limit feletti aflatoxin M1 szintet mértek tejben (Torkar & Vengust 2007, Polovinski-Horvatovic és mtsi. 2009). Romániában míg 1997-ben minden vizsgált kukoricaminta aflatoxin-mentes volt (Curtui és mtsi. 1998), viszont 2002-2004 között a vizsgált tételek 30%-ában delektáltak aflatoxinokat, 20%-ukban a határérték felett (Tabuc és mtsi. 2009).

Mikotxin termelő gombák hazai gabonatermő területeken történő megjelenését, illetve a gabonafélék mikotoxin szennyezettségét évek óta nyomon követjük (Tóth és mtsi 2012, 2013; Dobolyi és mtsi 2014).

A vizsgálatok alapján elmondható, hogy a 2010-es évi hűvös, csapadékos nyár inkább a Penicillium fajoknak kedvezett. Viszont a szárazabb, melegebb 2011 és 2012-es nyáron már egyre nagyobb számban fordultak elő potenciálisan aflatoxin termelő Aspergillusok is. Emellett számos esetben a gabonamintákban is kimutatható volt az aflatoxin B1 jelenléte. Néhány esetben az EU határérték feletti aflatoxin B1 szint is detektálható volt.

Mivel a mostani bejegyzésem egy kissé hosszúra sikerült, ezért a toxinmentesítési technikákról a következő bejegyzésben írok majd.

Aflatoxinok

Az Aspergillus nemzetségbe tartozó fajok több szempontból is lényegesek lehetnek:

• Először is számos ipari felhasználás szempontjából jelentős fajjal rendelkezik. Alkalmazzák az élelmiszer iparban citromsav gyártására, a fermentációs iparban pl.: szójaszósz előállítására, valamint a gyógyszeriparban lovasztatin gyártására.
• Emellett opportunista humán patogén szervezetek.
• Mezőgazdaságban igen nagymértékű hozamveszteségeket okozhatnak, ugyanis komoly szántóföldi és raktári penészek.
• Mindezek mellett számos mikotoxin termelő faj is tartozik a nemzetségbe.

Ebben a bejegyzésben az Aspergillus nemzetségbe tartozó gombák mikotoxin termelő képességéről írok, ezen belül is z aflatoxin termelőkről.

A mikotoxinok a fonalas gombák által termelt másodlagos anyagcseretermékek, melyek egyaránt károsak lehetnek az emberekre és az állatokra nézve is.

Az aflatoxinok az Aspergillus fajok által termelt egyik legjelentősebb toxin. A dekaketidek csoportjába sorolható, szerkezetileg szubsztituált kumarinszármazékok. UV fény alatt mutatott zöld- ill. kék fluoreszcenciájuk alapján megkülönböztetünk G- ill. B-típusú aflatoxinokat.

A termelő fajokat gyakran azonosítják földimogyorón, dión, gyapoton, rizsen, fűszerekben és gabonafélékben (kukorica, búza, rozs, árpa). 

Ha aflatoxinnal fertőzött takarmány kerül a szarvasmarha szervezetébe, az aflatoxin egy metabolizált formája, az aflatoxi M1 mutatható ki a tejből, és az abból készült tejtermékekben, sőt még a húsban is.

Az aflatoxin termelő, mintegy 20 faj, az Aspergillus nemzetség Flavi, Ochraceorosei és Nidulantes szekcióiba sorolhatók. Az alábbi táblázatban fetüntettem a termelő fajokat és a termelt aflatoxinokat.

Termelő fajok	Előfordulás	termelt toxin
Aspergillus section Flavi
A. arachidicola	Argentina, Brazil	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. bombycis	Japan, Indonesia, Brazil	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. flavus	Worldwide	Aflatoxin B1 & B2
A. minisclerotigenes	Argentina, USA, Australia, Nigeria, Portugal, Benin, Argentina, Morocco, Algeria	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. nomius	USA, Japan, Thailand, India, Brazil, Hungary, Serbia	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. novoparasiticus	Colombia, Brazil	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. parasiticus	USA, Japan, Australia, Brazil, India, South America, Uganda, Portugal, Italy, Serbia	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. parvisclerotigenus	Nigeria	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. pseudocaelatus	Argentina	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. pseudonomius	USA	Aflatoxin B1
A. pseudotamarii	Japan, Argentina, India, Brazil	Aflatoxin B1
A. togoensis	Central Africa	Aflatoxin B1
A. transmontanensis	Portugal	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. mottae	Portugal	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. sergii	Portugal	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
Aspergillus section Ochraceorosei
A. ochraceoroseus	Ivory Coast	AflatoxinsB1 & B2
A. rambellii	Ivory Coast	Aflatoxin B1 & B2
Aspergillus section Nidulantes
A.      astellatus (=Emericella astellata)	Ecuador	Aflatoxin B1
A.      olivicola (=Emericella olivicola)	Italy	Aflatoxin B1
A.      venezuelensis (=Emericella venezuelensis)	Venezuela	Aflatoxin B1

Az aflatoxinokat a Nemzetközi Rákkutató Ügynökség (IARC- International Agency for Research on Cancer) az erős rákkeltő hatásuk miatt a rákkeltő vegyületek 1. csoportjába sorolta.

Az aflatoxinok májkárosító hatású vegyületek. Akut esetben toxikus hepatitiszt, míg krónikus esetben májcirrózist, májrákot idézhetnek elő. 

Az aflatoxinok legveszélyesebb, kis dózisokhoz kötött hatása génkárosító és rákkeltő. In vitro emberi sejtekben az aflatoxinok (főként a B1)  klasztogének és mutagének, kovalensen kötődnek a DNS-hez (IARC, 1993; Mace és mtsai, 1997). Géntoxikus hatásukat élelmiszerekben a szokásos csírátlanító (dekontamináló, sterilizáló) kezelések után is megőrzik (Hoogenboom és mtsai, 2001). Metabolizációjuk  során az aflatoxinokból reaktív, epoxi vegyületek keletkeznek, amelyek ún. végső  karcinogének (rákkeltők); elsősorban ezek felelősek májrákot okozó hatásukért (IARC, 1993, Smela és mtsai, 2002). 

Eddig hazánkban főként importált termékek esetén fordult elő aflatoxin szennyezettség. Így pl.: brazil dió, pisztácia, földimogyoró esetében. A 2004-ben kirobbant "paprika botrányt" is aflatoxinnal szennyezett import paprika hazai paprikába történő bekeverése idézte elő.

Röviden ismertettem eddig az aflatoxinok előfordulását, a termelő fajokat, a káros hatásokat, előfordulásukat.  A következő bejegyzésben a hazai mezőgazdasági termékek aflatoxin szennyezettségéről írok majd, illetve néhány toxinmentesítési eljárást mutatok majd be.

Az előző bejegyzésben beszámoltam a DNS izolálás lépéseiről. A mai alkalommal a molekuláris azonosításhoz szükséges következő lépésről, vagyis a PCR reakcióról szeretnék írni. 

Az Aspergillus fajok elkülönítésére különböző módszerek léteznek, de pusztán morfológiai karakterek alapján a pontos meghatározásuk csak néhány faj esetén lehetséges. Molekuláris módszerekkel a fajok meghatározása biztosabb. Az Aspergillus fajok esetén a β-tubulin vagy kalmodulin gének szekvenciái megfelelőnek bizonyultak a fajszintű elkülönítéshez.

A PCR, vagyis a polimeráz láncreakció ma a legelterjedtebb módszer a fajok azonosításában. A PCR lényege, hogy egy fajspecifikus DNS szakaszt a megfelelő körülmények és indítószekvenciák (primer) segítségével nagy mennyiségben fel lehet szaporítani.

A reakció során az első lépés a denaturáció. Általában 94-95 °C-on történik, ekkor ugyanis a kettős szálú DNS szálai szétválnak. Ebben a lépésben a DNS-szálat összekötő hidrogén kötések felbomlanak. Ezt általában egy hosszabb (kb 4 perc) elő-denaturációs lépés is megelőzi.   

A második lépés az annealing, vagyis kapcsolódási fázis. Ekkor a hőmérsékletet a primertől függően csökkentik, ez általában a primer olvadási hőmérsékletétől 5 °C-al alacsonyabb. Ebben a lépésben a primerek hozzá tudnak kapcsolódni a DNS-szálhoz.

Végül a DNS-polimeráz meghosszabbítja a kívánt szakaszt a kapcsolódott primertől kezdődően. A szintetizálás során a szülő nukleinsav szál szolgál templátként a leány szál szintéziséhez.

Ezek után általában 35 ciklusban megismételjük a fentebb említett lépéseket ( denaturáció, annealing, polimerizáció). És a reakciót egy úgynevezett utó-polimerizációs lépés követi.

Az alábbi ábrán láthatók az egyes lépések. Forrás: http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction