DNS izolálás
A különböző DNS-izolálási technikák három alapvető
munkafázisra oszthatók (itt fonalas gombákra vonatkoztatva):
a) fonalas gomba tenyészet növesztése
b) fonalas gomba micélium összegyűjtése és a sejtek lízise
c) DNS tisztítása
a) A tenyésztéshez YPD
(élesztő-pepton-glükóz) tápoldatot használunk. Mivel kis mennyiségű micélium is
elegendő számunkra, így 1,5 ml tápoldatban végezzük a tenyésztést. Körülbelül
4-7 nap alatt megfelelő mennyiségű micéliumot kapunk, 25°C-os inkubációs
hőmérsékleten.
b) A micéliumtömeg mikrocentrifugálással ülepíthető. A felülúszót egyszerűen pipettával
eltávolíthatjuk.
A lízishez mechanikai módszereket
(esetünkben sterilizált finom szemcséjű homokkal való eldörzsölést) és hősokkot
(70°C-on, majd hirtelen 4°C-on történő inkubáció) is alkalmazunk a lízispuffer
hozzáadását követően. A sejtek alkalikus líziséhez lúgos (sodium lauroyl sarcosinate) oldat ot használunk, amely
dezintegrálja a membránok lipidszerkezetét. Emellett ez a kezelés a fehérjéket
és a DNS-t is denaturálja, és denaturált formában oldatban tartja.
A szolubilizált
fehérjék, membrántörmelékek és a hozzájuk kapcsolódó genomiális DNS kicsapása
savas kémhatású Na-acetát oldat segítségével történik. A DNS ennél a lépésnél is
az oldatban marad. A kicsapott komponenseket centrifugálással ülepítjük. A
tiszta felülúszó tartalmazza a DNS-t.
c) A DNS-t tartalmazó vizes fázishoz 98%-os etanolt (abszolút etanol) adunk, ami a DNS
kicsapódását eredményezi. A DNS így centrifugálással ülepíthető. A DNS-t tartalmazó csapadékot 70%-os etanollal kétszer mossuk
a sók eltávolításának céljából. A felülúszó eltávolítása után
beszárítjuk a mintát és TE pufferben (esetleg bidesztillált vízben) újra
feloldjuk.
És végezetül egy gélfotó egy DNS kivonás eredményességének ellenőrzéséről...
(a kék nyilak jelzik azt a sort, ahol a mintákban látható a DNS)
