Aflatoxin termelő képesség vizsgálata a laborban

Kedves olvasók! Sajnos a múlt hónapban elcsúsztam az augusztusi beszámolóval, ezért ebben a hónapban két bejegyzésem is született. Folytatva az eddigi vonalat most is aflatoxinokról fogok írni, viszont ebben a bejegyzésben bemutatom, hogy a vizsgálataimat hogyan is végzem el a laborban. Ezen kívül néhány érdekességet is bemutatnék, mellyel Indiában találkoztam.

Több különböző módszer kipróbálását követően a következőképpen történik az Aspergillus flavus izolátumok aflatoxin termelő képességének vizsgálata a csoportunkban. Először is egy indukáló tápoldatot készítünk, mely 2% élesztő kivonatot és 20% szacharózt tartalmaz. A szacharóz vagy étkezési cukor (nádcukor, répacukor, juharcukor) egy diszacharid, melyet egy glükóz és egy fruktóz molekularész alkot (C₁₂H₂₂O₁₁). A növények termelik és a heterotróf élőlények fontos tápláléka. Nagyon fontos még, hogy ne legyen csökkentett az élesztőkivonat sókoncentrációja.

Ezt követően a tápoldatot félkémcsövekbe mérjük, sterilizáljuk, majd a vizsgálni kívánt izolátumokat beleoltjuk. Az aflatoxin termelésnek kedvező feltétel a meleg, ezért 25 és 30 °C-on is vizsgáljuk az izolátumok aflatoxin termelő képességét. Az inkubáció 7-10 nap sötétben, ugyanis az aflatoxin fény hatására bomlik.

Ezután elvégezzük a toxin extrakciót. Mi általában diklór-metánt, vagy kloroformot használunk. Az extrakció során a toxin a vizes fázisból a szerves fázisba kerül. Centrifugálással a két fázis jól elkülöníthető. A szerves fázissal dolgozunk tovább. Mikrocentrifuga csövekbe mérjük a mintákat (általában 1-2 ml) és a szerves oldószer elpárologtatásával betöményítjük a mintákat.

Végül kis mennyiségű szerves oldószerben (kloroform ebben az esetben) újra felvesszük a mintát és vékonyréteg kromatográfiával vizsgáljuk. A vizsgálathoz rendelkezésünkre áll egy készülék (Camag, Linomat5), mely nagyban megkönnyíti a minták rétegre történő felvitelét. 

A felvitelt a réteg futtatása követi. Több próbálkozás után a toluol:etil-acetát:hangyasav 6:3:1 arányú keverékét találtuk a leghatékonyabb futtatóelegynek. Ebben az esetben a különböző extrahált metabolitok jól elkülönültek egymástól és az alkalmazott aflatoxin standard segítségével könnyen azonosíthatóak a mintákban a különböző aflatoxin formák. Az UV-fény alatt mutatott kék illetve zöld fluoreszcenciájuk alapján, valamint az eltérő Rf (retenciós faktor) értékek alapján, megkülönböztetünk aflatoxin B₁, B₂, G₁ és G₂-t („B-blue”, „G-green”).

Fent látható néhány kép a futtatás menetéről, egy futtatókádról és egy rétegről, melyet a Camag honlapjáról töltöttem le, mivel én nem rendelkezem ilyen szép fotóval.

Végezetül néhány érdekesség:

Lehetőségem volt tavaly novemberben egy hónapot eltölteni Indiában, ahol bepillantást nyerhettem egy szemklinika mikrobiológiai laboratóriumának, valamint egy egyetemi mikrobiológiai laboratórium munkájába is. A kinti hallgatók is vizsgálták az Aspergillus flavus izolátumok aflatoxin termelő képességét egy egészen más módszerrel. Kókusztejből készítenek táptalajt, amelyre egy specifikus (AFPA) táptalajon előnevelt A. flavus izolátumokat oltanak. Ha az adott izolátum termel aflatoxint, akkor UV fény alatt látható egy fluorszcens anyag a táptalajban. Ezt a kísérletet itthon is elvégeztem, de nem bizonyult olyan hatékonynak, mint a vékonyréteg kromatográfia. Indiában azért használhatják, mivel nagyon könnyen hozzájutnak a friss kókuszhoz, ezáltal nagyon olcsó, valamint nem kell egyéb szerves oldószerekkel, illetve analitikai módszerekkel dolgozniuk. Íme néhány csészefotó a konzerv kókusztejből készült táptalajon végzett kísérletről.

Mikotoxinokról általában

Az előző bejegyzésekben már sokat írtam az aflatoxinokról, melyek az Aspergillus nemzetségbe tartozó fonalas gombák közül néhány képes előállítani. Viszont az aflatoxinokon kívül számos más jelentős mikotoxin létezik. Ebben a bejegyzésben a mikotoxin-termelésről, a mikotoxikológia létrejöttéről lesz szó.

A gombák különböző módon károsíthatják az embert illetve az állatokat: 

Okozhatnak különböző mikózisokat, mikotoxikózisokat, micetizmusokat.

lDefiníció: fonalasgombák általában másodlagos anyagcsere-termékei, melyek az embert és/vagy az állatokat valamilyen módon károsítják .

lJelentőség: az ember és háziállatai táplálékát, illetve környezetét szennyezhetik, különböző kórképeket válthatnak ki.

Itt tisztáznám a másodlagos metabolitok fogalmát is:

Nem elengedhetetlenül szükségesek a sejt életben maradásához, ellentétben az elsődleges anyagcseretermékekkel . Nem fordulnak elő minden élőlényben, csak néhány faj termel egy adott vegyületet. Általában kis méretűek és a sejt életének csak egy adott szakaszában termelődnek. Szerepük többnyire ismeretlen.

Ezzel szemben az elsődleges metabolitok: 

lA normális növekedéshez, reprodukcióhoz, fejlődéshez szükségesek, általában a log fázisban termelődnek . Szigorúan szabályozott termelődésük.Tudjuk, mi mire való.

A mikotoxinok több, különböző módon is bejuthatnak a szervezetbe.

lKözvetlen szennyezésként (szennyezett növény fogyasztása révén, pl. liszt)

lKözvetve (mikotoxinnal szennyezett takarmányt fogyasztó állatokból származó élelmiszerek révén; pl. sertés vese)

lÉlelmiszeriparban alkalmazott mikotoxin termelő gombák okozta szennyezés révén (pl. fermentált szalámi, szójaszósz)

lGombaspórák belégzése (ochratoxinok, makrociklikus trichotecének)

lGombafertőzés hatására a szervezetben is termelődhet (ochratoxinok, fumonizinek, gliotoxin, oxálsav)

Néhány mikotoxin hatásmódja látható ezen az ábrán.

Mikotoxikológia

A mikotoxinokkal foglalkozó tudományág az 1960-as években jött létre. Ekkor ugyanis egy rejtélyes betegség pusztított a pulykák körében Angliában, mely több mint 100.000 pulyka elhullását okozta. A vizsgálatok során májkárosodást mutattak ki az állatokban. A betegséggel a takarmányba kevert toxinnal szennyezett földimogyorót hozták összefüggésbe. A tápból egy fonalasgombát is izoláltak, melyet Aspergillus flavus-ként azonosítottak. A toxikus anyagot, utalva a termelő gombára, aflatoxinnak nevezték el. 

Végezetül egy képet választottam, amelyre összegyűjtöttem néhány olyan élelmiszert, melyek tartalmazhatnak mikotoxinokat. Tehát nem törvényszerű, de előfordulhat mikotoxin szennyezés számos fermentált-, húsipari-, tejipari élelmiszerben, importált termékekben, valamint hazai mezőgazdasági termékekben is.