Aflatoxinok előfordulása hazánkban

AFLATOXINOK 2.

Korábbi bejegyzésemben röviden ismertettem az aflatoxinok előfordulását, a termelő fajokat, a káros hatásukat, valamint előfordulásukat különböző mezőgazdasági termékekben. 

Mostani bejegyzésemben a hazai mezőgazdasági termékek aflatoxin szennyezettségéről írok majd.

Az aflatoxin termelés  kedvező környezeti feltétele a nedvesség és a magas hőmérséklet. Ezért az A. flavus melegebb, trópusi és szubtrópusi területeken képes aflatoxinokat előállítani. Következtetésképpen, a közép-európai országokban (Olaszország, Szerbia, Szlovénia, Horvátország, Románia, Ukrajna), melyek a mérsékelt éghajlati övben helyezkednek el, a mezőgazdasági termékek aflatoxin -szennyezettsége eddig nem jelent ett komoly egészségügyi kockázatot.

Azonban a globális felmelegedés által okozott klímaváltozás jelentős változásokat idézett elő. Az utóbbi időben több tanulmány is foglalkozott az éghajlatváltozás hatására megjelenő aflatoxin termelő gombákkal és az aflatoxinok élelmiszerekben történő előfordulásával. 

Létezik egy az EU tagországokban működő, az élelmiszerekre és a takarmányokra vonatkozó gyorsvészjelző rendszer (RASFF, Rapid Alert System for Food and Feed). A tagállamok haladéktalanul jelentik a Bizottságnak a sürgősségi riasztórendszeren keresztül az élelmiszerekből és takarmányokból származó, az emberi egészséget közvetve vagy közvetlenül érintő veszélyt. A rendszer kiterjed a tagállamokra, a Bizottságra és a Hatóságra. A RASFF rendszerében a beérkező bejelentések, az élelmiszer-biztonsági kockázat mértéke alapján több kategóriába sorolhatók.

Ezen jelzőrendszeren keresztül az utóbbi közel 10 évben számos riasztás érkezett közép-európai országokból. Így Horvátországban aflatoxin termelőket azonosítottak kukoricán (Kosalec & Pepeljnjak 2005, Halt és mtsi. 2004). Észak-Olaszországban aflatoxin termelő A. flavus-t és EU határérték feletti aflatoxin kontaminációt detektáltak kukoricán (Giorni és mtsi. 2007). Szlovéniában és Szerbiában EU limit feletti aflatoxin M1 szintet mértek tejben (Torkar & Vengust 2007, Polovinski-Horvatovic és mtsi. 2009). Romániában míg 1997-ben minden vizsgált kukoricaminta aflatoxin-mentes volt (Curtui és mtsi. 1998), viszont 2002-2004 között a vizsgált tételek 30%-ában delektáltak aflatoxinokat, 20%-ukban a határérték felett (Tabuc és mtsi. 2009).

Mikotxin termelő gombák hazai gabonatermő területeken történő megjelenését, illetve a gabonafélék mikotoxin szennyezettségét évek óta nyomon követjük (Tóth és mtsi 2012, 2013; Dobolyi és mtsi 2014).

A vizsgálatok alapján elmondható, hogy a 2010-es évi hűvös, csapadékos nyár inkább a Penicillium fajoknak kedvezett. Viszont a szárazabb, melegebb 2011 és 2012-es nyáron már egyre nagyobb számban fordultak elő potenciálisan aflatoxin termelő Aspergillusok is. Emellett számos esetben a gabonamintákban is kimutatható volt az aflatoxin B1 jelenléte. Néhány esetben az EU határérték feletti aflatoxin B1 szint is detektálható volt.

Mivel a mostani bejegyzésem egy kissé hosszúra sikerült, ezért a toxinmentesítési technikákról a következő bejegyzésben írok majd.

Aflatoxinok

Az Aspergillus nemzetségbe tartozó fajok több szempontból is lényegesek lehetnek:

• Először is számos ipari felhasználás szempontjából jelentős fajjal rendelkezik. Alkalmazzák az élelmiszer iparban citromsav gyártására, a fermentációs iparban pl.: szójaszósz előállítására, valamint a gyógyszeriparban lovasztatin gyártására.
• Emellett opportunista humán patogén szervezetek.
• Mezőgazdaságban igen nagymértékű hozamveszteségeket okozhatnak, ugyanis komoly szántóföldi és raktári penészek.
• Mindezek mellett számos mikotoxin termelő faj is tartozik a nemzetségbe.

Ebben a bejegyzésben az Aspergillus nemzetségbe tartozó gombák mikotoxin termelő képességéről írok, ezen belül is z aflatoxin termelőkről.

A mikotoxinok a fonalas gombák által termelt másodlagos anyagcseretermékek, melyek egyaránt károsak lehetnek az emberekre és az állatokra nézve is.

Az aflatoxinok az Aspergillus fajok által termelt egyik legjelentősebb toxin. A dekaketidek csoportjába sorolható, szerkezetileg szubsztituált kumarinszármazékok. UV fény alatt mutatott zöld- ill. kék fluoreszcenciájuk alapján megkülönböztetünk G- ill. B-típusú aflatoxinokat.

A termelő fajokat gyakran azonosítják földimogyorón, dión, gyapoton, rizsen, fűszerekben és gabonafélékben (kukorica, búza, rozs, árpa). 

Ha aflatoxinnal fertőzött takarmány kerül a szarvasmarha szervezetébe, az aflatoxin egy metabolizált formája, az aflatoxi M1 mutatható ki a tejből, és az abból készült tejtermékekben, sőt még a húsban is.

Az aflatoxin termelő, mintegy 20 faj, az Aspergillus nemzetség Flavi, Ochraceorosei és Nidulantes szekcióiba sorolhatók. Az alábbi táblázatban fetüntettem a termelő fajokat és a termelt aflatoxinokat.

Termelő fajok	Előfordulás	termelt toxin
Aspergillus section Flavi
A. arachidicola	Argentina, Brazil	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. bombycis	Japan, Indonesia, Brazil	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. flavus	Worldwide	Aflatoxin B1 & B2
A. minisclerotigenes	Argentina, USA, Australia, Nigeria, Portugal, Benin, Argentina, Morocco, Algeria	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. nomius	USA, Japan, Thailand, India, Brazil, Hungary, Serbia	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. novoparasiticus	Colombia, Brazil	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. parasiticus	USA, Japan, Australia, Brazil, India, South America, Uganda, Portugal, Italy, Serbia	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. parvisclerotigenus	Nigeria	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. pseudocaelatus	Argentina	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. pseudonomius	USA	Aflatoxin B1
A. pseudotamarii	Japan, Argentina, India, Brazil	Aflatoxin B1
A. togoensis	Central Africa	Aflatoxin B1
A. transmontanensis	Portugal	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. mottae	Portugal	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
A. sergii	Portugal	Aflatoxin B1, B2 & G1, G2
Aspergillus section Ochraceorosei
A. ochraceoroseus	Ivory Coast	AflatoxinsB1 & B2
A. rambellii	Ivory Coast	Aflatoxin B1 & B2
Aspergillus section Nidulantes
A.      astellatus (=Emericella astellata)	Ecuador	Aflatoxin B1
A.      olivicola (=Emericella olivicola)	Italy	Aflatoxin B1
A.      venezuelensis (=Emericella venezuelensis)	Venezuela	Aflatoxin B1

Az aflatoxinokat a Nemzetközi Rákkutató Ügynökség (IARC- International Agency for Research on Cancer) az erős rákkeltő hatásuk miatt a rákkeltő vegyületek 1. csoportjába sorolta.

Az aflatoxinok májkárosító hatású vegyületek. Akut esetben toxikus hepatitiszt, míg krónikus esetben májcirrózist, májrákot idézhetnek elő. 

Az aflatoxinok legveszélyesebb, kis dózisokhoz kötött hatása génkárosító és rákkeltő. In vitro emberi sejtekben az aflatoxinok (főként a B1)  klasztogének és mutagének, kovalensen kötődnek a DNS-hez (IARC, 1993; Mace és mtsai, 1997). Géntoxikus hatásukat élelmiszerekben a szokásos csírátlanító (dekontamináló, sterilizáló) kezelések után is megőrzik (Hoogenboom és mtsai, 2001). Metabolizációjuk  során az aflatoxinokból reaktív, epoxi vegyületek keletkeznek, amelyek ún. végső  karcinogének (rákkeltők); elsősorban ezek felelősek májrákot okozó hatásukért (IARC, 1993, Smela és mtsai, 2002). 

Eddig hazánkban főként importált termékek esetén fordult elő aflatoxin szennyezettség. Így pl.: brazil dió, pisztácia, földimogyoró esetében. A 2004-ben kirobbant "paprika botrányt" is aflatoxinnal szennyezett import paprika hazai paprikába történő bekeverése idézte elő.

Röviden ismertettem eddig az aflatoxinok előfordulását, a termelő fajokat, a káros hatásokat, előfordulásukat.  A következő bejegyzésben a hazai mezőgazdasági termékek aflatoxin szennyezettségéről írok majd, illetve néhány toxinmentesítési eljárást mutatok majd be.

Az előző bejegyzésben beszámoltam a DNS izolálás lépéseiről. A mai alkalommal a molekuláris azonosításhoz szükséges következő lépésről, vagyis a PCR reakcióról szeretnék írni. 

Az Aspergillus fajok elkülönítésére különböző módszerek léteznek, de pusztán morfológiai karakterek alapján a pontos meghatározásuk csak néhány faj esetén lehetséges. Molekuláris módszerekkel a fajok meghatározása biztosabb. Az Aspergillus fajok esetén a β-tubulin vagy kalmodulin gének szekvenciái megfelelőnek bizonyultak a fajszintű elkülönítéshez.

A PCR, vagyis a polimeráz láncreakció ma a legelterjedtebb módszer a fajok azonosításában. A PCR lényege, hogy egy fajspecifikus DNS szakaszt a megfelelő körülmények és indítószekvenciák (primer) segítségével nagy mennyiségben fel lehet szaporítani.

A reakció során az első lépés a denaturáció. Általában 94-95 °C-on történik, ekkor ugyanis a kettős szálú DNS szálai szétválnak. Ebben a lépésben a DNS-szálat összekötő hidrogén kötések felbomlanak. Ezt általában egy hosszabb (kb 4 perc) elő-denaturációs lépés is megelőzi.   

A második lépés az annealing, vagyis kapcsolódási fázis. Ekkor a hőmérsékletet a primertől függően csökkentik, ez általában a primer olvadási hőmérsékletétől 5 °C-al alacsonyabb. Ebben a lépésben a primerek hozzá tudnak kapcsolódni a DNS-szálhoz.

Végül a DNS-polimeráz meghosszabbítja a kívánt szakaszt a kapcsolódott primertől kezdődően. A szintetizálás során a szülő nukleinsav szál szolgál templátként a leány szál szintéziséhez.

Ezek után általában 35 ciklusban megismételjük a fentebb említett lépéseket ( denaturáció, annealing, polimerizáció). És a reakciót egy úgynevezett utó-polimerizációs lépés követi.

Az alábbi ábrán láthatók az egyes lépések. Forrás: http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

Néhány szó a DNS izolálásról

DNS izolálás

A különböző DNS-izolálási technikák három alapvető munkafázisra oszthatók (itt fonalas gombákra vonatkoztatva):

a) fonalas gomba tenyészet növesztése

b) fonalas gomba micélium összegyűjtése és a sejtek lízise

c) DNS tisztítása

a) A tenyésztéshez YPD (élesztő-pepton-glükóz) tápoldatot használunk. Mivel kis mennyiségű micélium is elegendő számunkra, így 1,5 ml tápoldatban végezzük a tenyésztést. Körülbelül 4-7 nap alatt megfelelő mennyiségű micéliumot kapunk, 25°C-os inkubációs hőmérsékleten.

b) A micéliumtömeg mikrocentrifugálással ülepíthető. A felülúszót egyszerűen pipettával eltávolíthatjuk.

A lízishez mechanikai módszereket (esetünkben sterilizált finom szemcséjű homokkal való eldörzsölést) és hősokkot (70°C-on, majd hirtelen 4°C-on történő inkubáció) is alkalmazunk a lízispuffer hozzáadását követően. A sejtek alkalikus líziséhez  lúgos (sodium lauroyl sarcosinate) oldat ot használunk, amely dezintegrálja a membránok lipidszerkezetét. Emellett ez a kezelés a fehérjéket és a DNS-t is denaturálja, és denaturált formában oldatban tartja.

A szolubilizált fehérjék, membrántörmelékek és a hozzájuk kapcsolódó genomiális DNS kicsapása savas kémhatású Na-acetát oldat segítségével történik. A DNS ennél a lépésnél is az oldatban marad. A kicsapott komponenseket centrifugálással ülepítjük. A tiszta felülúszó tartalmazza a DNS-t.

c) A DNS-t tartalmazó vizes fázishoz 98%-os etanolt (abszolút etanol) adunk, ami a DNS kicsapódását eredményezi. A DNS így centrifugálással ülepíthető. A DNS-t tartalmazó csapadékot 70%-os etanollal kétszer mossuk a sók eltávolításának céljából. A felülúszó eltávolítása után beszárítjuk a mintát és TE pufferben (esetleg bidesztillált vízben) újra feloldjuk.

És végezetül egy gélfotó egy DNS kivonás eredményességének ellenőrzéséről...

(a kék nyilak jelzik azt a sort, ahol a mintákban látható a DNS)

Februári tevékenységem

Az első bejegyzésemben röviden összegeztem, hogy mivel is foglalkozom a PhD munkám során. Most szeretnék pontosabb képet adni az Aspergillus nemzetségről (szó szerint J )

Először is ezen a sematikus ábrán látható az Aspergillusokra jellemző konídiumszerkezet.

Valamint egy fénymikroszkóppal készített kép, szintén a konídiumszerkezetről.

Az Aspergillus fajok elkülönítésére különböző módszerek léteznek, de pusztán morfológiai karakterek alapján a pontos meghatározásuk csak néhány faj esetén lehetséges. Molekuláris módszerekkel a fajok meghatározása biztosabb.

Ehhez először is néhány szóban bemutatnám a polimeráz láncreakciót (PCR), amely ma a legelterjedtebb módszer a fajok azonosításában. A PCR lényege, hogy egy fajspecifikus DNS szakaszt a megfelelő körülmények és indítószekvenciák (primer) segítségével nagy mennyiségben fel lehet szaporítani. Az Aspergillus fajok esetén a β-tubulin vagy kalmodulin gének szekvenciái megfelelőnek bizonyultak a fajszintű elkülönítéshez.

Mindez számunkra azért nagyon fontos, mert az indiai szemklinikáról érkezett mintákat előzetes morfológiai jellemzők alapján már megpróbálták azonosítani. Az izolátumok molekuláris azonosítását viszont mi végezzük el. A korábban A. flavus-ként érkezett 52 izolátumból a kalmodulin gén egy szakaszának amplifikálása és szekvencia analízise révén elvégezett fajazonosítást eredményeként a legtöbb azonosított izolátum az A. flavus fajba tartozott, míg három az A. tamarii és egy az A. pseudotamarii fajba volt sorolható.

Ismételten érkezett előzetes morfológiai azonosítást követően 25 A. flavus-ként, valamint 5-5 A. tamarii-ként, A. terreus-ként és A. fumigatus-ként azonosított izolátum. Ezen izolátumok molekuláris azonosítását fogom a közeljövőben elvégezeni. Ennek lépéseit a következő blogbejegyzésben fogom részletezni.

Bemutatkozás

Kedves Olvasó!

Először is köszöntök mindenkit, aki felkereste a blogomat.

Néhány szóban szeretnék bemutatkozni. Baranyi Nikolett vagyok, harmad éves PhD hallgató. Munkámat öt évvel ezelőtt kezdtem szakdolgozóként a Szegedi Tudományegyetem Természettudományi és Informatikai Karának Mikrobiológia Tanszékén Dr. Varga János és Dr. Kocsubé Sándor témavezetésével. 

Már kezdetektől az Aspergillus nemzetség Flavi szekciójába sorolható fonalasgomba izolátumokkal, elsősorban Aspergillus flavus-szal dolgozom. 

A továbbiakban röviden bemutatnám a munkám két fő irányvonalát.  

Az Aspergillus nemzetségbe sorolható fajok igen jelentősek a klinikumban. A munkánk során vizsgált klinikai izolátumok jelentős részét egy indiai szemklinikától kapjuk (Aravind Eye Hospital, Coimbatore, Tamil Nadu, India). Ezen fajok a leggyakoribb előidézői a gombák által okozott keratitisznek (szaruhártya gyulladás) szubtrópusi illetve trópusi területeken. A fertőzés fő kockázati tényezője a növényi részek által okozott trauma a mezőgazdasági munka során. Az Aspergillus fajok közül főként az A. flavus, A. terreus, A. fumigatus és A. niger okoz keratitiszt. 

Számos mezőgazdasági termékről származó potenciálisan mikotoxintermelő izolátumot is vizsgálunk. A mikotoxinok a fonalas gombák másodlagos anyagcseretermékei, amelyek egyaránt ártalmasak az emberekre és az állatokra nézve is. Az aflatoxinok a legjelentősebb mikotoxinok, melyeket az Aspergillus nemzetség fajai állítanak elő. A számos ismert aflatoxin közül az aflatoxin B1 a leginkább mérgező. Erős mutagén rákkeltő hatást mutattak ki laboratóriumi állatoknál, és sok bizonyíték utal arra, hogy emberek esetén a máj rákos elváltozását okozhatja. Az aflatoxin B1 a természetben előforduló legerősebb rákkeltő anyag, melynek hatására májkárosodás és májrák alakulhat ki. Az Aspergillus flavus az egyik legjelentősebb aflatoxin termelő faj, emellett fontos mezőgazdasági kártevő. Különböző mezőgazdasági termények esetében (kukorica, gyapot és földimogyoró) súlyos hozamveszteséget okoz világszerte. Az aflatoxin termelésnek kedvező környezeti feltételei a nedvesség és a magas hőmérséklet, ezért az A. flavus elsősorban a melegebb, trópusi és szubtrópusi területeken szennyezi aflatoxinokkkal a mezőgazdasági termékeket. A közép-európai országokban (Olaszország, Szerbia, Szlovénia, Horvátország, Románia, Ukrajna), melyek a mérsékelt éghajlati övben helyezkednek el, a mezőgazdasági termékek aflatoxin-szennyezettsége nem jelentett komoly egészségügyi kockázatot.

Azonban a globális felmelegedés által okozott klímaváltozás jelentősen befolyásolta a toxintermelő törzsek elterjedését. Az utóbbi időben több tanulmány is foglalkozott az éghajlatváltozás hatására megjelenő aflatoxintermelő gombákkal és az aflatoxinok élelmiszerekben történő előfordulásával. 

Végül egy kis karácsonyi hangulat utólag :)