Az előző bejegyzésben beszámoltam a DNS izolálás lépéseiről. A mai alkalommal a molekuláris azonosításhoz szükséges következő lépésről, vagyis a PCR reakcióról szeretnék írni. 

Az Aspergillus fajok elkülönítésére különböző módszerek léteznek, de pusztán morfológiai karakterek alapján a pontos meghatározásuk csak néhány faj esetén lehetséges. Molekuláris módszerekkel a fajok meghatározása biztosabb. Az Aspergillus fajok esetén a β-tubulin vagy kalmodulin gének szekvenciái megfelelőnek bizonyultak a fajszintű elkülönítéshez.

A PCR, vagyis a polimeráz láncreakció ma a legelterjedtebb módszer a fajok azonosításában. A PCR lényege, hogy egy fajspecifikus DNS szakaszt a megfelelő körülmények és indítószekvenciák (primer) segítségével nagy mennyiségben fel lehet szaporítani.

A reakció során az első lépés a denaturáció. Általában 94-95 °C-on történik, ekkor ugyanis a kettős szálú DNS szálai szétválnak. Ebben a lépésben a DNS-szálat összekötő hidrogén kötések felbomlanak. Ezt általában egy hosszabb (kb 4 perc) elő-denaturációs lépés is megelőzi.   

A második lépés az annealing, vagyis kapcsolódási fázis. Ekkor a hőmérsékletet a primertől függően csökkentik, ez általában a primer olvadási hőmérsékletétől 5 °C-al alacsonyabb. Ebben a lépésben a primerek hozzá tudnak kapcsolódni a DNS-szálhoz.

Végül a DNS-polimeráz meghosszabbítja a kívánt szakaszt a kapcsolódott primertől kezdődően. A szintetizálás során a szülő nukleinsav szál szolgál templátként a leány szál szintéziséhez.

Ezek után általában 35 ciklusban megismételjük a fentebb említett lépéseket ( denaturáció, annealing, polimerizáció). És a reakciót egy úgynevezett utó-polimerizációs lépés követi.

Az alábbi ábrán láthatók az egyes lépések. Forrás: http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

Néhány szó a DNS izolálásról

DNS izolálás

A különböző DNS-izolálási technikák három alapvető munkafázisra oszthatók (itt fonalas gombákra vonatkoztatva):

a) fonalas gomba tenyészet növesztése

b) fonalas gomba micélium összegyűjtése és a sejtek lízise

c) DNS tisztítása

a) A tenyésztéshez YPD (élesztő-pepton-glükóz) tápoldatot használunk. Mivel kis mennyiségű micélium is elegendő számunkra, így 1,5 ml tápoldatban végezzük a tenyésztést. Körülbelül 4-7 nap alatt megfelelő mennyiségű micéliumot kapunk, 25°C-os inkubációs hőmérsékleten.

b) A micéliumtömeg mikrocentrifugálással ülepíthető. A felülúszót egyszerűen pipettával eltávolíthatjuk.

A lízishez mechanikai módszereket (esetünkben sterilizált finom szemcséjű homokkal való eldörzsölést) és hősokkot (70°C-on, majd hirtelen 4°C-on történő inkubáció) is alkalmazunk a lízispuffer hozzáadását követően. A sejtek alkalikus líziséhez  lúgos (sodium lauroyl sarcosinate) oldat ot használunk, amely dezintegrálja a membránok lipidszerkezetét. Emellett ez a kezelés a fehérjéket és a DNS-t is denaturálja, és denaturált formában oldatban tartja.

A szolubilizált fehérjék, membrántörmelékek és a hozzájuk kapcsolódó genomiális DNS kicsapása savas kémhatású Na-acetát oldat segítségével történik. A DNS ennél a lépésnél is az oldatban marad. A kicsapott komponenseket centrifugálással ülepítjük. A tiszta felülúszó tartalmazza a DNS-t.

c) A DNS-t tartalmazó vizes fázishoz 98%-os etanolt (abszolút etanol) adunk, ami a DNS kicsapódását eredményezi. A DNS így centrifugálással ülepíthető. A DNS-t tartalmazó csapadékot 70%-os etanollal kétszer mossuk a sók eltávolításának céljából. A felülúszó eltávolítása után beszárítjuk a mintát és TE pufferben (esetleg bidesztillált vízben) újra feloldjuk.

És végezetül egy gélfotó egy DNS kivonás eredményességének ellenőrzéséről...

(a kék nyilak jelzik azt a sort, ahol a mintákban látható a DNS)

Februári tevékenységem

Az első bejegyzésemben röviden összegeztem, hogy mivel is foglalkozom a PhD munkám során. Most szeretnék pontosabb képet adni az Aspergillus nemzetségről (szó szerint J )

Először is ezen a sematikus ábrán látható az Aspergillusokra jellemző konídiumszerkezet.

Valamint egy fénymikroszkóppal készített kép, szintén a konídiumszerkezetről.

Az Aspergillus fajok elkülönítésére különböző módszerek léteznek, de pusztán morfológiai karakterek alapján a pontos meghatározásuk csak néhány faj esetén lehetséges. Molekuláris módszerekkel a fajok meghatározása biztosabb.

Ehhez először is néhány szóban bemutatnám a polimeráz láncreakciót (PCR), amely ma a legelterjedtebb módszer a fajok azonosításában. A PCR lényege, hogy egy fajspecifikus DNS szakaszt a megfelelő körülmények és indítószekvenciák (primer) segítségével nagy mennyiségben fel lehet szaporítani. Az Aspergillus fajok esetén a β-tubulin vagy kalmodulin gének szekvenciái megfelelőnek bizonyultak a fajszintű elkülönítéshez.

Mindez számunkra azért nagyon fontos, mert az indiai szemklinikáról érkezett mintákat előzetes morfológiai jellemzők alapján már megpróbálták azonosítani. Az izolátumok molekuláris azonosítását viszont mi végezzük el. A korábban A. flavus-ként érkezett 52 izolátumból a kalmodulin gén egy szakaszának amplifikálása és szekvencia analízise révén elvégezett fajazonosítást eredményeként a legtöbb azonosított izolátum az A. flavus fajba tartozott, míg három az A. tamarii és egy az A. pseudotamarii fajba volt sorolható.

Ismételten érkezett előzetes morfológiai azonosítást követően 25 A. flavus-ként, valamint 5-5 A. tamarii-ként, A. terreus-ként és A. fumigatus-ként azonosított izolátum. Ezen izolátumok molekuláris azonosítását fogom a közeljövőben elvégezeni. Ennek lépéseit a következő blogbejegyzésben fogom részletezni.

Bemutatkozás

Kedves Olvasó!

Először is köszöntök mindenkit, aki felkereste a blogomat.

Néhány szóban szeretnék bemutatkozni. Baranyi Nikolett vagyok, harmad éves PhD hallgató. Munkámat öt évvel ezelőtt kezdtem szakdolgozóként a Szegedi Tudományegyetem Természettudományi és Informatikai Karának Mikrobiológia Tanszékén Dr. Varga János és Dr. Kocsubé Sándor témavezetésével. 

Már kezdetektől az Aspergillus nemzetség Flavi szekciójába sorolható fonalasgomba izolátumokkal, elsősorban Aspergillus flavus-szal dolgozom. 

A továbbiakban röviden bemutatnám a munkám két fő irányvonalát.  

Az Aspergillus nemzetségbe sorolható fajok igen jelentősek a klinikumban. A munkánk során vizsgált klinikai izolátumok jelentős részét egy indiai szemklinikától kapjuk (Aravind Eye Hospital, Coimbatore, Tamil Nadu, India). Ezen fajok a leggyakoribb előidézői a gombák által okozott keratitisznek (szaruhártya gyulladás) szubtrópusi illetve trópusi területeken. A fertőzés fő kockázati tényezője a növényi részek által okozott trauma a mezőgazdasági munka során. Az Aspergillus fajok közül főként az A. flavus, A. terreus, A. fumigatus és A. niger okoz keratitiszt. 

Számos mezőgazdasági termékről származó potenciálisan mikotoxintermelő izolátumot is vizsgálunk. A mikotoxinok a fonalas gombák másodlagos anyagcseretermékei, amelyek egyaránt ártalmasak az emberekre és az állatokra nézve is. Az aflatoxinok a legjelentősebb mikotoxinok, melyeket az Aspergillus nemzetség fajai állítanak elő. A számos ismert aflatoxin közül az aflatoxin B1 a leginkább mérgező. Erős mutagén rákkeltő hatást mutattak ki laboratóriumi állatoknál, és sok bizonyíték utal arra, hogy emberek esetén a máj rákos elváltozását okozhatja. Az aflatoxin B1 a természetben előforduló legerősebb rákkeltő anyag, melynek hatására májkárosodás és májrák alakulhat ki. Az Aspergillus flavus az egyik legjelentősebb aflatoxin termelő faj, emellett fontos mezőgazdasági kártevő. Különböző mezőgazdasági termények esetében (kukorica, gyapot és földimogyoró) súlyos hozamveszteséget okoz világszerte. Az aflatoxin termelésnek kedvező környezeti feltételei a nedvesség és a magas hőmérséklet, ezért az A. flavus elsősorban a melegebb, trópusi és szubtrópusi területeken szennyezi aflatoxinokkkal a mezőgazdasági termékeket. A közép-európai országokban (Olaszország, Szerbia, Szlovénia, Horvátország, Románia, Ukrajna), melyek a mérsékelt éghajlati övben helyezkednek el, a mezőgazdasági termékek aflatoxin-szennyezettsége nem jelentett komoly egészségügyi kockázatot.

Azonban a globális felmelegedés által okozott klímaváltozás jelentősen befolyásolta a toxintermelő törzsek elterjedését. Az utóbbi időben több tanulmány is foglalkozott az éghajlatváltozás hatására megjelenő aflatoxintermelő gombákkal és az aflatoxinok élelmiszerekben történő előfordulásával. 

Végül egy kis karácsonyi hangulat utólag :)